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血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及发病机制

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【摘要】 目的研究血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆障碍及发病机制。方法 4血管阻断法制作模型，Morris水迷宫法检测学习记忆能力，免疫组化法观察Bcl2和Bax表达，流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率，亚甲蓝比色法检测血清中H2S含量。结果模型组大鼠学习记忆能力明显减退。Bcl2/Bax在缺血再灌注(I/R)开始时升高，随后开始下降。模型组大鼠海马神经细胞凋亡率明显增加。模型组大鼠血清中H2S含量明显减少。血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率间呈明显负相关。结论 VD可导致学习记忆障碍，海马神经细胞凋亡和血清中H2S含量减少;海马神经细胞凋亡程度可能与内源性H2S生成减少有关。

【关键词】 血管性痴呆;学习记忆;免疫组化;流式细胞术;硫化氢

血管性痴呆(VD)是老年期痴呆的主要类型之一，它是由一系列脑血管因素(缺血、出血、急慢性缺氧性脑血管病等)导致脑组织损害引起的以认知功能障碍为特征的痴呆综合征〔1〕，不仅给病人带来长期痛苦，严重影响其生活质量，而且给家庭、社会造成沉重负担，因此研究VD的发病机制以指导其防治具有很高的社会价值和现实意义。H2S是第三类气体信号分子，广泛参与机体的多种生理和病理过程，为进一步了解其在VD发病中的作用，本研究观察大脑缺血/再灌注(I/R)不同时间对大鼠学习记忆能力的影响、血清中H2S含量改变及海马CA1区神经细胞凋亡情况，从行为学、细胞凋亡及内源性H2S表达量及其相互关系等方面，探讨VD的发病机制，为其防治提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与分组健康Wistar雄性大鼠64只，体重300～350 g(由河北省实验动物中心提供)，随机分为8组，正常组，假手术组和VD模型组，VD模型组又分为大脑I/R 2，8，24，72，168和720 h组，每组8只动物。

　　1.2 动物模型制备 4血管阻断法(4VO法)〔2〕建立VD大鼠模型。假手术组麻醉及手术过程与VD模型组相同，但不电凝双侧椎动脉，不阻断双侧颈总动脉。术后按再灌注的不同时间分别将动物处死,经主动脉依次灌注生理盐水100 ml和4%多聚甲醛500 ml，取出脑组织，石蜡包埋切片，用于免疫组化显示Bcl2、Bax及苏木素伊红(HE)染色。

　　1.3 学习记忆能力的测定 Morris水迷宫检测〔3〕：实验开始于VD术后4 w，预先将迷宫任意分为4个象限。平台放入上述4个象限中随机选择的1个象限中，在大鼠游泳池边标记4点作为大鼠的入水点，记录120 s内大鼠从入水到爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期。记录各组大鼠的逃避潜伏期，作为学习记忆能力检测指标。

　　1.4 取材大鼠10%水合氯醛(3 ml/kg体重)腹腔注射麻醉后，快速开胸暴露心脏，心尖取血4～5 ml，分离血清，用于血清H2S含量测定;然后断头处死，并立即在冰台上开颅，迅速分离大鼠海马，用70%酒精固定，4℃冰箱保存过夜，用于流式细胞术检测。

　　1.5 HE染色切片常规脱蜡至水→1%盐酸酒精分化→伊红染色2 min→切片常规梯度酒精脱水→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→中性树胶封固。

　　1.6 免疫组化染色(SP法) Bax兔抗鼠多克隆抗体，Bcl2兔抗鼠多克隆抗体(Santa Cruz公司生产)。

　　1.7 流式细胞术检测采用美国Beckman Coulter公司生产的EpicsXL Ⅱ型流式细胞仪。

　　1.8 血清中H2S含量的检测亚甲蓝分光光度法。

　　1.9 统计学处理用SPSS13.0统计软件，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。

　　2 结果

　　2.1 学习记忆能力检测结果各组大鼠在迷宫各入水点搜索平台的结果见表1，随着训练天数的增加，各组大鼠的逃避潜伏期均缩短，第2天I/R 720 h组与正常组和假手术组比较逃避潜伏期明显延长(P<0.01);正常组和假手术组逃避潜伏期差异不显著(P>0.05)。

　　2.2 VD大鼠病理形态学结果 HE染色后，神经细胞胞浆呈淡红色，核呈蓝黑色。假手术组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、密集，细胞完整，结构正常，胞浆丰富，胶质细胞无增生;细胞核呈圆形、椭圆形，无变性，无固缩或溶解现象。VD模型组海马CA1区神经元排列紊乱，神经元变性，体积变小，胞核与胞浆界限不清，核固缩成三角形或不规则形，而且随I/R时间的延长，变性神经元数目越多，见图1。　表1 各组逃避潜伏期比较

　　2.3 凋亡蛋白表达结果

　　2.3.1 VD大鼠模型海马CA1区Bcl2表达 VD模型组I/R 2 h Bcl2蛋白平均OD值开始明显上调，I/R 8 h达到高峰，之后随I/R时间的延长开始下降，但I/R 24 h组仍高于假手术组。假手术组与I/R不同时间点组间，Bcl2的表达情况均有显著差异(P<0.01)(表2)。

　　2.3.2 VD大鼠模型海马CA1区Bax的表达 I/R早期Bax在海马CA1区的表达明显增强，随着再灌注时间的延长，其表达量不断增加，I/R 72～168 h达高峰。假手术组与I/R不同时间点组之间，Bax的表达均有显著差异(P<0.01)(表2)。

2.3.3 Bcl2/Bax比率变化随I/R时间的延长，Bcl2/Bax的比率逐渐降低(表2)。表2 VD大鼠Bcl2、Bax的表达水平与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

　　2.4 流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率结果随着I/R时间的延长，大鼠海马神经细胞凋亡率逐渐增高，其中I/R 2 h组凋亡率最低，I/R 168 h组凋亡率最高。VD模型各时间组与假手术组比较，海马神经细胞凋亡率明显增加(P<0.01);I/R不同时间组间两两比较，各组间海马神经细胞凋亡率均差异显著(P<0.01)，见表3。

　　2.5 血清H2S含量检测结果随着I/R时间的延长，大鼠血清H2S含量呈现直线降低趋势，其中IR 2 h组血清H2S含量最高，I/R 168 h组血清H2S含量最低。VD模型各时间组与正常组和假手术组比较，血清H2S含量明显减少(P<0.01);I/R不同时间组间两两比较，血清H2S含量均差异显著(P<0.01);正常组和假手术组血清H2S含量无显著差异(P>0.05)，见表3。

　　2.6 血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率相关分析随着血清H2S含量的降低，海马神经细胞凋亡率逐渐升高，两者呈现明显的负相关，回归方程为：y=-0.135x+12.068，相关系数r=-0.861(P<0.01)，提示内源性H2S可能具有保护神经细胞的功能。表3 各组海马神经细胞凋亡率及血清H2S含量(各组间两两比较：1)P<0.01

　　3 讨论

　　目前认为，I/R后神经元死亡的机制是损伤级联反应，脑缺血性损伤级联反应大多以能量衰竭和兴奋性氨基酸毒性开始，以细胞凋亡结束。本实验中用HE染色观察到海马CA1区大量细胞呈现明显的凋亡特征，VD模型组大鼠海马CA1区可见神经元排列紊乱，神经元变性，体积变小，核固缩成三角形或不规则形，胞核与胞浆界限不清。流式细胞术检测海马神经细胞的凋亡率发现VD模型各组与假手术组相比海马神经细胞凋亡率明显增加，而且随着I/R时间的延长，大鼠海马神经细胞的凋亡率逐渐增加。

　　在参与调控神经元凋亡的基因和蛋白质产物中，一类是抗凋亡蛋白，包括Bcl2，BclxL，Bclω，Al等;另一类是促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bad等〔4〕。体外研究显示〔5〕：Bcl2保护细胞免于各种损伤。本实验结果显示VD模型组I/R 2 h后Bcl2蛋白平均光密度值开始明显上调，IR 8 h达到高峰，之后开始下降，但IR 72 h仍高于假手术组;而Bax蛋白在I/R早期在海马CA1区的表达明显增强，且随着再灌注时间的延长，其表达不断增加。Bcl2蛋白家族中促凋亡和抑凋亡两类蛋白的比例即Bcl2/Bax的比率决定细胞在受到凋亡信号刺激后是否发生凋亡〔6〕，本次研究显示Bcl2/Bax的比率随I/R时间的延长逐渐降低，而大鼠海马神经细胞的凋亡率则逐渐增加，这也从另一方面证实了Bcl2蛋白的抗凋亡作用。

　　VD主要表现为学习记忆能力的降低，而海马是学习记忆的重要结构，I/R损伤后海马区的神经细胞凋亡势必对学习记忆功能产生重要的影响。本研究利用Morris水迷宫技术对VD模型大鼠的空间学习记忆能力进行测试，发现I/R 720 h组较正常组和假手术组的逃避潜伏期明显延长，表明VD可造成大鼠学习记忆功能障碍，其机制可能是I/R损伤引起海马神经细胞凋亡，从而导致海马学习记忆功能障碍。

　　H2S是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后被发现的另一种具有神经调节作用的新型气体信号分子〔7〕，H2S不仅在神经系统发挥重要的生理作用，而且还可作为一种内源性的抗氧化剂，在氧化应激时能够清除羟自由基等活性氧簇〔8，9〕，具有抗氧化、恢复认知功能、调节脑血流量等作用，也提示H2S可能也参与老年痴呆动物或病人神经元的保护〔10〕。本研究结果显示随着大脑I/R时间的延长，各组大鼠血清H2S含量均减少，而海马CA1区凋亡神经细胞数逐渐增加;随着血清H2S含量的降低，海马神经细胞凋亡率逐渐升高，两者间呈现明显的负相关关系，提示内源性H2S对脑I/R损伤中的神经细胞具有保护作用，可以减少细胞凋亡的发生。关于H2S发挥保护作用的机制尚不十分清楚，有研究表明，对于体外培养的心肌细胞，H2S可通过直接清除H2O2和O2而减少脂质过氧化产物MDA的生成〔11〕;对于神经细胞，H2S可抑制过氧亚硝酸盐介导的细胞毒性作用，抑制细胞内蛋白质分子的氧化和硝基化〔8〕，或者通过促进还原型谷胱甘肽的产生而对抗氧化应激损伤〔9〕，H2S被证实可激活ATP敏感的K通道(KATP)〔12〕，从而起到细胞保护作用。综上所述，I/R损伤可引起内源性H2S含量降低，从而导致海马神经细胞凋亡率升高;I/R损伤后大鼠学习记忆功能障碍是海马神经细胞凋亡的必然结果。因此，提供外源性H2S或H2S供体以降低海马神经细胞凋亡率可能是治疗VD的新方法。

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　　5 田金洲. 血管性痴呆〔M〕. 北京：人民卫生出版社，2003：271.

　　6 刘亚君，崔鹤，谢东萍，等. Bcl2和Bax在缺血预处理保护海马神经元缺血再灌注损伤中的作用〔J〕. 山东大学学报(医学版)，2006;44(3)：230.

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　　9 Kimura Y, Kimura H. Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stress〔J〕. FASEBJ, 2004;18(10):11657.

　　10 Legator MS, Singleton CR, Morris DL,et al.Health effects from chronic lowlevel exposure to hydrogen sulfide〔J〕. Arch Environ Health, 2001;56(2):12331.

　　11 Geng B, Chang L, Pan C,et al. Endogenous hydrogen sulfide regulation of myocardial injury induced by isoproterenol〔J〕. Biochem Biophys Res Commun, 2004;318(3):75673.

　　12 Zhao W, Zhang J, Lu Y,et al.The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATP channel opener〔J〕. EMBO, 2001;20(21)：600816.